转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

The Identification of QTL Associated with Cotton Fruit Branch Length Suitable for Mechanized Harvest Utilizing BSA-seq

[Objective] This study aims to identify quantitative trait loci (QTLs) associated with cotton fruit branch length by using the combination of bulked-segregant analysis (BSA) and next-generation sequencing (NGS) method. [Method] In this study, the cotton F₂ segregating population was developed with the short branch line Sujimian 125 and long-branch variety Sikang 1 as cross parents. According to the average internode length of fruit branches in middle, extreme individuals in F₂ population were divided into two groups to generate the bulked DNA samples. The whole-genome resequencing of two DNA bulks was applied to analyze the single nucleotide polymorphism (SNP) and insertion-deletion (InDel) between two groups, and the fruit branch internode length related QTLs were detected using Euclidean distance (ED). [Result] With SNP data obtained from sequencing, a 0.8 Mbp range associated region on chromosome A3 was identified; with InDel data obtained from sequencing, a 1.09 Mbp range associated region on chromosome A3 was identified. Two regions overlapped, and the overlapped range was 0.77 Mbp. [Conclusion] This result suggested that the difference between I-type fruit branch and zero-type was due to different genetic locus and pattern rather than dosage effect of the same gene.     

Agrobacterium-mediated transformation of the CrDAT gene and selection of transgenic periwinkle lines with a high vincristine accumulation

Catharanthus roseus contains vincristine and vinblastine, which are outstanding drugs for cancer. In the biosynthetic pathways of terpenoid indole alkaloids (TIAs) in C. roseus, deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (DAT) is a key enzyme that catalyses the last reaction of vindoline biosynthesis to form vinblastine and vincristine. In this study, the CrDAT transgene was transferred into the periwinkle by Agrobacterium-mediated transformation and generated transgenic periwinkle lines with an increase in vincristine accumulation. The C. roseus DAT gene was introduced into C. roseus plants and it was confirmed that CrDAT was successfully transferred into the genome of periwinkle plants and efficiently translated to synthesise recombinant DAT protein. Four transgenic periwinkle lines in T1 generation, T1-1, T1-3, T1-6, and T1-7, expressed recombinant DAT protein with the total protein content in the range of 2.86 μg.mg^?1 to 5.12 μg.mg^?1. Moreover, the vincristine contents of four transgenic lines increased by 1.63?2.48-fold compared to non-transgenic plants, ranging from 6.91 µg.g^?1 (fresh weight) to 10.53 µg.g^?1 (fresh weight). The T1-1 line had the highest vincristine content. Hence, the overexpression of the recombinant DAT protein can improve the vincristine accumulation of transgenic C. roseus plants.

Abbreviation: CrDAT - Catharanthus roseus Deacetylvindoline-4-O-Acetyl Transferase; D4H - Deacetoxyvindoline 4-hydroxylase; ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Monoterpene indole alkaloid; T0, T1 - Generations of transgenic plants; TIAs - Terpenoid indole alkaloids; WT- The wild-type tobacco plants (non transgenic plant); 35S - Cauliflower mosaic virus 35S promoter     

新疆机采棉花实现叶片快速脱落需要的温度条件

随着机采棉的快速推进,籽棉含杂率过高导致清理工序过多及纤维不必要的损伤。新疆棉区棉花生长后期的热量资源有限,如何合理喷施脱叶催熟剂是改善原棉品质的关键技术措施。本研究采用分期喷施脱叶催熟剂的方式,探讨了温度变化对棉花叶片脱落率的影响及实现棉花叶片快速脱落需要的温度条件。结果表明,在喷施脱叶催熟剂后(7.0±1.0)d内,棉花叶片脱落率最高,达55%～79%,且与最高温度和每日≥12°C有效积温呈显著的线性关系。若要在喷施脱叶催熟剂后(7.0±1.0)d内实现55%的叶片脱落率,则应满足该时间段最高温度大于27.2°C、每日≥12°C有效积温大于7.0°C·日的要求。因此,喷施脱叶催熟剂后(7.0±1.0) d内是实现良好脱叶效果的关键时间段,期间的最高温度和每日≥12°C有效积温则是影响的关键因素。     

强闪光抑制棉花叶片光系统Ⅱ活性和热耗散

除持续强光导致光合作用效率降低外,强闪光也能够影响光合功能,但规律和机制尚不清楚。为研究强闪光对喜光植物棉花叶片光合功能的影响,选用陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种新陆早45号为材料,于强闪光处理(20,000μmol m–2 s–1, 300 ms,间隔10 s,处理时间持续30 min)前后分别测定叶绿素荧光、P700和气体交换。结果表明,强闪光处理后不仅有活性的PSI (光系统I)反应中心含量下降,同时PSⅡ (光系统Ⅱ)电子传递活性也受到限制。与对照相比,强闪光处理后PSI的ΦND (PSI供体侧限制引起的非光化学量子产量)下降,ΦNA (PSI受体侧限制引起的非光化学量子产量)增加,暗示强闪光能够抑制PSI受体侧电子传递活性。强闪光处理不仅使PSⅡ的实际量子产量明显下降,而且非光化学猝灭和ΦNPQ (PSⅡ调节性能量耗散的量子产量)也降低;但是,ΦNO (PSⅡ非调节性能量耗散的量子产量)明显增加,表明强闪光导致热耗散降低和PSⅡ失活。此外,强闪光处理后光合速率和气孔导度均降低,但细胞间隙CO2浓度增加,证明强闪光处理后同化能力的降低不是气孔限制导致的。因此,本研究认为强闪光处理不仅抑制PSI活性,而且导致PSⅡ失活和可调节性热耗散下降;光合电子传递活性的下降可能是强闪光下光合速率降低的重要原因。     

农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T₁代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L^-1 KT、0.5 mg·L^-1 6-BA和0.05 mg·L^-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L^-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L^-1 CuSO₄显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T₀代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T₁代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

陆地棉新品种生物学特性与品质特性鉴定结果分析

对2016-2017年引进的62个陆地棉新品种进行了形态特征、生物学特性和品质特性的鉴定及分析。结果表明：目前收集的新材料以中早熟棉为主,铃重以中等大小为主,衣分中等,悬殊较大,马克隆数值普遍偏大。     

水稻OsUBA基因的表达及其在促进种子萌发和开花中的功能

自噬是将功能异常或不需要的胞内组分降解的细胞学过程,广泛参与真核生物的生长发育过程、对营养缺乏的响应及生物/非生物胁迫反应。NBR1 (Next to BRCA1 gene 1, NBR1)是在植物中发现的最重要的自噬受体,但有关植物NBR1类自噬受体的研究较少,水稻中此类蛋白的研究还是空白。本文通过RT-PCR方法,从水稻日本晴幼苗的cDNA中克隆到一个含有泛素相关结构域(Ubiquitinassociated,UBA)的基因,将其命名为OsUBA。OsUBA的开放阅读框长2538 bp,编码845个氨基酸残基。OsUBA属于水稻中的NBR1类蛋白。OsUBA的启动子区有多个与光、逆境胁迫及激素反应相关的元件; OsUBA基因在水稻花药、正在萌发的种子以及根中的表达量较高,在茎和叶中也有表达; 200μmol L~(–1) ABA处理显著抑制OsUBA的表达,100μmol L~(–1) GA处理后OsUBA的表达略有升高。对OsUBA过表达水稻株系的研究表明,转基因水稻种子的萌发比野生型更快, ABA (3μmol L~(–1))处理显著抑制OsUBA过表达水稻株系种子的萌发, GA (100μmol L~(–1))处理对OsUBA过表达水稻株系种子的萌发略有促进;OsUBA过表达水稻株系的开花时间较野生型明显提前。这些结果表明,水稻NBR1蛋白基因OsUBA的表达和功能可能与对开花时间和种子萌发的调控以及生物/非生物胁迫反应有关。     

2个抗虫棉的外源Bt基因分子鉴定及其染色体定位

以中美2个抗虫棉品种GK19与33B为试验材料,利用检测中美Bt基因的特异性引物,分别对抗虫棉亲本GK19和33B进行PCR扩增,并通过SSR分子标记技术对其Bt基因进行分子鉴定与染色体定位,旨在从外源基因转化事件的视角探究中美转基因抗虫棉差异的分子基础。结果表明, GK19为中国转Bt基因抗虫棉, 33B为美国转Bt基因抗虫棉; GK19的Bt基因被定位在棉花Chr.20上,共16对SSR多态性标记与其Bt基因连锁,两侧的分子标记为NAU3907和NAU2579,其遗传距离分别为2.4 cM和1.5 cM; 33B的Bt基因被定位在棉花Chr.26上,共20对SSR多态性标记与Bt基因连锁,目标Bt基因位于标记NAU460和dc40260之间,其遗传距离分别为3.6 cM和2.0 cM。以上结果表明GK19和33B属于不同的遗传转化事件。